Vyšetření aneuploidií chromosomů 13, 18, 21, X a Y metodou QF-PCR
Rychlé vyšetření plodové vody a choriových klků provádíme metodou QF-PCR. Metodikou se zabýváme na našem pracovišti již od roku 2002, modifikovali jsme ji tak, aby výsledek vyšetření byl informativní pro většinu pacientů. Naše výsledky jsme opakovaně publikovali v odborných zahraničních časopisech:
O metodě QF-PCR
Tato metoda nezahrnuje vyšetření celého karyotypu, má však nesporné výhody oproti metodám klasickým. V optimálním případě lze podezření na nejčastější aneuploidie jmenovaných chromozomů potvrdit či vyvrátit během 24 hodin. V případech, kdy ultrazvukové (UZ) vyšetření odhalí závažné VVV v prvním trimestru těhotenství (nasvědčující aneuploidii některého ze zmíněných chromozomů), umožní pacientkám v případě pozitivního nálezu rychle rozhodnout o dalším osudu těhotenství.
QFPCR není zatím zcela plnohodnotnou náhradou za klasické cytogenetické vyšetření karyotypu plodu, neboť nedokáže identifikovat všechny typy případných abnormalit. Vyšetření tedy není indikováno ve všech případech, jeho použití závisí na úvaze klinického genetika. V současné době se indikuje v případech, kdy hrozí buď nebezpečí z prodlení - odběr plodové vody po 22.týdnu těhotenství (TT) - nebo v případě vysokého rizika vrozené chromozomální aberace (VCA) pro plod. Každý den čekání navíc znamená pro budoucí rodiče zbytečný stres, který lze použitím metody QF-PCR alespoň částečně zmírnit.
Přehled chromozomálních aberací odhalitelných metodou QF-PCR
Trizomie autozomů 13, 18 a 21 a aneuploidie gonozomů X a Y jsou zodpovědné za 90% chromozomálně podmíněných VVV. Trizomie 13, 18 a 21 jsou jediné autozomální trizomie, které jsou postnatálně slučitelné se životem.
Downův syndrom
Nejčastější a nejznámější vrozenou chromozomální aberací (VCA) je Downův syndrom (karyotyp např. 47,XY, + 21), který byl poprvé popsán v roce 1866, ale jeho skutečná příčina zůstala utajena ještě dalších sto let. Podezření na chromozomální anomálii se potvrdilo až v r. 1959. V literatuře se uvádí incidence 1 na 700 novorozenců. Nejdůležitějšími fenotypovými znaky je mongoloidní vzhled (epikanty), celková hypotonie, psychomotorická retardace, „opičí“ rýha na dlaních, stále pootevřená ústa s velkým jazykem, menší silnější postava. Častý je výskyt VVV srdce nebo epilepsie, pacienti mívají zvýšené riziko vzniku leukémií. Délka života je obvykle zkrácena a již ve středním věku se může projevit demence alzheimerovského typu (Pritchard a Korf, 2007 ).
Více než 95% případů Downova syndromu je způsobeno tzv. volnou trizomií choromozomu 21 vzniklou nondisjunkcí během meiózy. Zbylých 5% je způsobeno translokacemi - časté jsou robertsonské translokace (14;21) - či nondisjunkcí během mitotického dělení v somatických buňkách. Toto vede k mozaikovým formám Downova syndromu, kdy dochází ke zmenšení výskytu a snížení závažnosti jednotlivých fenotypových projevů v závislosti na procentuálním zastoupení trizomických buněk v jednotlivých tkáních.
Patauův syndrom
Tento syndrom (karyotyp např. 47,XX, + 13) poprvé diagnostikoval Patau v r. 1960. Vyskytuje se s incidencí asi 1 na 5000 novorozenců. Děti se rodí většinou předčasně s typickou kraniofaciální dysmorfií (rozštěpy rtu a patra, mikrognacie, poruchy vývoje očí) a anomáliemi končetin (polydaktylie). Psychický a somatický vývoj je velmi retardován. Pacienti často umírají již během prvního měsíce, až 86% umírá do konce prvního roku života. Podkladem uvedených klinických projevů je přibližně v 75% případů volná trizomie chromozomu 13. Dále může být tento syndrom způsoben translokací nebo mozaikou normálních a trizomických buněk.
Edwardsův syndrom
Edwardsův syndrom (karyotyp např. 47,XX, + 18) byl také popsán v roce 1960. Vyskytuje se s incidencí 1 : 3000 novorozenců (Pritchard a Korf, 2007). Jedinci ženského pohlaví jsou postiženi čtyřikrát častěji, což je pravděpodobně způsobeno častějším odumřením plodů mužského pohlaví během prenatálního vývoje. Charakteristická je těžká psychomotorická retardace, celková hypotonie a mnohočetné VVV. Průměrná doba přežití se uvádí asi 2 měsíce, pouze 10% přežívá jeden rok. Trizomie chromozomu 18 se nejčastěji vyskytuje jako volná, jen malý podíl pacientů má mozaikové či translokační formy.
Nejčastější aneuploidie pohlavních chromozomů (gonosomů)
V porovnání s autozomálními aberacemi jsou aneuploidie gonozomů podstatně rozmanitější, ale méně závažné. Mezi hlavní příznaky patří různé anomálie pohlavních orgánů a na ně navazující poruchy reprodukce u obou pohlaví; dalším příznakem jsou mentální retardace různého rozsahu. Obecně platí, že čím více je nadpočetných chromozomů X, tím budou projevy mentální retardace výraznější.
Turnerův syndrom
Turnerův syndrom způsobený monozomií gonozomu X (karyotyp 45,X) je nejčastější gonozomální aberací, četnost výskytu je přibližně 1 : 2500 živě narozených dívek. I přesto, že je tato VCA slučitelná se životem, dochází ke spontánnímu potracení až 95% plodů. Pacientky s kompletním Turnerovým syndromem mají ženský fenotyp, častá bývá sterilita a v některých případech i poruchy intelektu. Charakteristická je kožní řasa mezi krkem a rameny, tzv. pterygium. U novorozenců se často vyskytuje lymfedém na končetinách. Kompletní Turnerův syndrom zahrnuje jen asi polovinu případů, zbytek tvoří mozaiky (nejčastěji 45,X/46,XX). Linie buněk s normálním karyotypem zmírňují fenotypové projevy. V případě, že „normální“ linii představuje mužský karyotyp (46,XY) nebo jeho aberace (47,XXY; 47,XYY), případně jejich různé kombinace, dochází opět ke zmírnění projevů. Současně však můžeme pozorovat různý stupeň virilizace (rozvoje druhotných mužských pohlavních znaků).
Klinefelterův syndrom
Klinefelterův syndrom představuje relativně častou gonozomální aberaci u jedinců mužského pohlaví s incidencí přibližně 1 na 500 - 1000 živě narozených chlapců. Fenotyp je v zásadě mužský, avšak s gynekomastií (zvětšením prsních žláz) a ochlupením ženského typu. Pacienti jsou vyššího vzrůstu s prodlouženými končetinami; jsou zpravidla infertilní v důsledku hypoplazie varlat. IQ kolísá v širokém rozpětí. Nejčastější zjištěný karyotyp je 47, XXY, přičemž nadbytečný chromozom X pochází většinou od matky. Stejně jako u Turnerova syndromu existuje celá řada atypických forem, ať už na podkladě mozaiky nebo polyzomie chromozomů X a Y.
Se stoupajícím počtem nadbytečných chromozomů X se zvyšuje mentální postižení pacientů.
Syndrom XXX (superfemale syndrom)
Výskyt se odhaduje na jeden případ na 1000 živě narozených dívek. Fenotypické projevy jsou charakterizovány vyšším vzrůstem, občasnou mentální subnormou. Tvrzení o snížené fertilitě jsou nyní občas připisována případům, kdy u jedinců s mozaikou 46, X/47, XXX vznikají oocyty s aneuploidním karyotypem.
Syndrom XYY (supermale syndrom)
Incidence se odhaduje stejně jako u předchozího, 1 na 1000 živě narozených chlapců. Pacienti mají velmi vysokou postavu, v některých případech opožděný vývoj řeči či poruchy učení, někdy problémy s pohybovou koordinací. Fertilita je normální. Teorie o predispozici k agresivnímu chování, které se dříve uváděly, nejsou všeobecně potvrzeny.
Princip diagnostiky nejčastějších aneuploidií metodou QF-PCR za využití STR markerů
Typy repetitivních sekvencí
Lidský jaderný genom tvoří sekvence 3 miliard párů bází DNA. Z toho jen nepatrný zlomek (asi 2%) jsou geny potřebné pro tvorbu proteinů. Valná většina genomové sekvence je tvořena sekvencemi, jejichž smysl není znám (nekódující sekvence) – patří k nim introny a repetitivní (opakované) sekvence. To jsou úseky, v nichž se mnohokrát za sebou opakuje určitá skupina nukleotidů.
Repetitivní sekvence tvoří přibližně 30% lidského genomu. Rozsah jednotlivých úseků tvořených těmito sekvencemi je individuálně specifický pro každý jednotlivý chromozom. Z toho vyplývá, že i homologické chromozomy mohou mít v různých lokusech rozdílný počet repetic.
Rozeznáváme následující druhy repetitivních sekvencí:
- rozptýlené repetice, jednotlivé kopie na různých místech genomu
- tandemové repetice, kopie sekvenčního motivu ležící v blocích v řadě za sebou
Tandemové repetitivní sekvence jsou v lidském genomu široce rozšířené a v populaci vysoce variabilní. Jednou z podskupin jsou tzv. mikrosatelity (STR), jejichž základní opakující se sekvence sestává z jednoho až šesti nukleotidů (obr.1). STR lokusy jsou v genomu rozptýleny v mnoha kopiích a jsou lokalizovány jak v genech, tak i mimo ně. Nacházejí se na všech chromozomech; využívají se též v kriminalistice pro identifikaci osob a desítky z nich byly nebo jsou testovány i pro využití v medicíně.
Schéma tandemové repetice
U homozygota obě alely nesou stejný počet opakování základního motivu (AATG) a vykazují tedy stejnou délku.
U heterozygota obě alely nesou různý počet opakování základního motivu a jsou různě dlouhé.
Příklady výsledků vyšetření nejčastějších aneuploidií
Příklady výsledků vyšetření metodou QF-PCR
Příklad výsledku vyšetření QF-PCR pomocí setu STRmarkerů. Délky fragmentů jsou (v bp) uvedeny na horizontální ose, arbitrární fluorescenční jednotky jsou uvedeny na vertikální ose. STR markery jsou identifikovány na základě fluorescečního značení a délky fragmentu. Karyotyp vyšetřovaného plodu 47, XY + 21: produkty markerů D21S1432 a D21S1411 vykazují poměr hrotů 2:1, markery D21S1435, D21S1437, D21S11 vykazují 3 hroty v poměru 1:1:1. Výsledek markeru D21S1412 vykazuje neinformativní výsledek.